1864년(고종) 전라남도 보성군(寶城郡) 문덕면(文德面)에서 출생했으며  7세 때 서울에 올라와 외숙인 판서(判書) 김성근(金聲根) 밑에서 한학을 배웠다. 1882년 19세 때 별시문과에 합격, 교서관 부정자(校書館 副正字)직에 임명된다.

3개월 후 임오군란이 발발했다. 서재필도 서양식 군대기술의 필요성을 절감, 신식 군사기술 습득을 위해 1883년 김옥균의 권유로 일본의 도야마[戶山] 육군유년학교(陸軍幼年學校)에 입학하여 8개월 간의 훈련을 마치고 이듬해 5월 졸업하였다.

1884년 12월 김옥균이 주도하는 갑신정변에 가담하였고  정변의 실패로 일본을 거쳐 1885년 미국으로 망명하였다. 펜실베이주 월크스베아시에 있는 해밀힐고등학교에 입학해 1889년 졸업, 1889년 컬럼비안대학(Columbian University 지금의 조지워싱턴대학)에 입학하였다. 1890년 한국인으로는 최초로 미국 시민권을 취득하였고, 1893년 대학을 졸업 의사 면허를 취득하였다.

1896년 4월 정부예산을 얻어 독립신문을 발간한후 독립협회(獨立協會)를 결성하고 모화관(慕華館)을 인수·개축하여 독립회관으로 하였다. 1896년초부터 2년 4개월동안 독립신문을 간행하여 대내적으로 정부의 실정을 비판하고 개혁을  독려하였으며, 대외적으로 국권회복과 조국의 자주독립에 온 힘을 쏟았다.

1897년 영은문(迎恩門)을 헐고 그 자리에 독립문을 세웠으나 수구파(守舊派)들의 저항으로 1898년 다시 미국으로 돌아갔다. 펜실베이니아에서 병원을 개업, 3·1운동 소식을 전해 듣고 한국친우회(The League of Friends of Korea)를 조직하여 독립운동을 후원하기 위해 노력하였다. 1951년 생애를 마감했다.1977년 건국훈장 대한민국장이 추서되었으며 1994년 4월 8일 서울 동작동 국립묘지에 안장되었다.